ISOLATION AND STUDY OF OPTIMIZATION FOR INULINASE PRODUCTION FROM FUNGI USING RESPONSE SURFACE METHODOLOGY

Abstract

The objective of the research was to isolate fungal from garlic waste samples from the garlic oil extraction group around Ban Tham Subdistrict, Dok Khamtai District, Phayao Province and to find suitable conditions for producing inulin enzyme from fungi. The study found that there were 12 isolates of fungi capable of producing Inulinase, namely GP1, GP2, GP3, GP4, GP5, GP6, GP7, GP8, GP9, GP10, GP11, and GP12. Fungi with the potential to produce Inulinase the most found isolates were GP2, GP3 and GP10. When the fungus was identified by ITS gene analysis, it was found that the isolates (GP2, GP3, and GP10) were like the fungus strains Aspergillus japonicus, Aspergillus niger, and Penicillium citrinum, respectively. From studying the effects of factors in the production of Inulinase enzyme in liquid fermentation (Submerge fermentation) using a single factor method.The appropriate fungal culture conditions were predicted using the Central composite design (CCD) response surface method. The results found that the concentration of carbon source (Inulin extract from garlic pulp powder), inorganic nitrogen sources (NH4)2SO4) and organic nitrogen (Yeast extract) are factors affecting the cultivation, clearly growing fungi. Which when predicting appropriate fungal cultivation conditions, the highest Inulinase enzyme production was obtained with A. japonicus GP2 under conditions with a carbon source concentration of 2.6%, inorganic nitrogen source 1% and organic nitrogen 0.8%, which can produce Inulinase 16.03 U/ml. A. niger GP3 was highest under conditions of carbon source. Inorganic nitrogen sources and organic nitrogen concentration were 1.4%, 1.01%, and 0.82%, respectively. Inulinase was able to produce 14.77 U/ml and P. citrinum GP10 was the highest under conditions of high concentration. Of the carbon source Inorganic nitrogen sources and organic nitrogen were 3%, 1.75%, and 0.55%, respectively, with the ability to produce Inulinase 9.62 U/ml. Afterwards, an experiment was conducted by cultivating all species of fungi with appropriate conditions as above, it was found that A. japonicus GP2, A. niger GP3 and P. citrinum GP10 were capable of producing inulinase enzyme at 15.05, 16.03, and 1.95 U/ml, respectively. The enzyme activity values of the fungi A. japonicus GP2 and A. niger GP3 are consistent with the predictions, as indicated by the analysis results. For P. citrinum GP10, it was found that the enzyme activity values obtained were less than those predicted in the analysis. However, the equation and the prediction results are still lacking in reliability. Because due to the p-value analysis of Lack of fit is less than 0.05 (P=0.000).

งานวิจัยมีวัตถุประสงค์เพื่อคัดแยกราจากตัวอย่างกากกระเทียมจากกลุ่มสกัดน้ำมันกระเทียมในเขตพื้นที่ ต.บ้านถ้ำ อ.ดอกคำใต้ จ.พะเยา และหาสภาวะที่เหมาะสมในการผลิตเอนไซม์อินูลิเนสจากรา จากการศึกษาพบว่าราที่มีความสามารถในการผลิตอินูลิเนสมี 12 ไอโซเลท ได้แก่ GP1 GP2 GP3 GP4 GP5 GP6 GP7 GP8 GP9 GP10 GP11 และ GP12 ราที่มีศักยภาพในการสามารถผลิตอินูลิเนสได้มากที่สุด คือ GP2 GP3 และ GP10 ซึ่งเมื่อระบุชนิดของราโดยการวิเคราะห์ยีนบริเวณ ITS พบว่าราไอโซเลท (GP2 GP3 และ GP10) มีความคล้ายคลึงกับราสายพันธุ์ Aspergillus japonicus, Aspergillus niger และ Penicillium citrinum ตามลําดับ จากการศึกษาผลของปัจจัยการผลิตเอนไซม์อินูลิเนสในการหมักแบบอาหารเหลว (Submerge fermentation) ด้วยวิธีปัจจัยเดียว และได้ทํานายสภาวะเพาะเลี้ยงราที่เหมาะสมด้วยวิธีการพื้นผิวตอบสนองแบบส่วนประสมกลาง (Central composite design, CCD) ผลพบว่าความเข้มข้นของแหล่งคาร์บอน (สารสกัดอินนูลินจากผงกากกระเทียม) แหล่งอนินทรีย์ไนโตรเจน ((NH4)2SO4) และอินทรีย์ไนโตรเจน (Yeast extract) เป็นปัจจัยที่มีผลต่อการเพาะเลี้ยงราอย่างชัดเจน ซึ่งในขั้นตอนการทํานายสภาวะเพาะเลี้ยงราที่เหมาะสม แสดงให้เห็นว่าปริมาณการผลิตเอนไซม์อินูลิเนสสูงสุดจาก A. japonicus GP2 จะเกิดขึ้นสูงสุดภายใต้สภาวะที่มีความเข้มข้นของแหล่งคาร์บอน 2.6% แหล่งอนินทรีย์ไนโตรเจน 1% และอินทรีย์ไนโตรเจน 0.8% โดยสามารถผลิตอินูลิเนสได้ 16.03 ยูนิตต่อมิลลิลิตร ในขณะที่ A. niger GP3 ภายใต้สภาวะที่มีความเข้มข้นของแหล่งคาร์บอน แหล่งอนินทรีย์ไนโตรเจน และอินทรีย์ไนโตรเจน เท่ากับ 1.4%, 1.01% และ 0.82% ตามลําดับ โดยสามารถผลิตอินูลิเนสได้ 14.77 ยูนิตต่อมิลลิลิตร และ P. citrinum GP10 ภายใต้สภาวะที่มีความเข้มข้นของแหล่งคาร์บอน แหล่งอนินทรีย์ไนโตรเจน และอินทรียไนโตรเจนเท่ากับ 3%, 1.75% และ 0.55% ตามลําดับ โดยสามารถผลิตอินูลิเนสสูงสุดได้ 9.62 ยูนิตต่อมิลลิลิตร จากนั้นเมื่อเพาะเลี้ยงราด้วยสภาวะที่เหมาะสมดังกล่าวข้างต้นพบว่า A. japonicus GP2, A. niger GP3 และ P. citrinum GP10 สามารถผลิตเอนไซม์อินูลิเนสได้ 15.05, 16.03 และ 1.95 ยูนิตต่อมิลลิลิตร ตามลำดับ จากผลการวิเคราะห์จะเห็นว่ารา A. japonicus GP2 และ A. niger GP3 มีค่ากิจกรรมเอนไซม์ใกล้เคียงกับค่าที่ทํานายไว้ ส่วน P. citrinum GP10 พบว่าค่ากิจกรรมเอนไซม์ที่ได้มีค่าน้อยกว่าที่ได้จากการทำนายในการวิเคราะห์ แต่อย่างไรก็ตามสมาการ และผลการทำนายที่ได้ยังขาดความน่าเชื่อถือ เนื่องจากการวิเคราะห์ p-value ของ Lack of fit มีค่าน้อยกว่า 0.05 (P=0.000)