PROCESS DEVELOPMENT FOR ISOLATION, FUSION AND CULTURE OF PROTOPLAST FROM LEAVES OF VETIVER, KAMPHAENG PHET 2 (Vetiveria zizanioides) AND PRACHUAP KHIRI KHAN (Vetiveria nemoralis)

Abstract

Vetiver (Vetiveria spp.) belongs to Poaceae family which is used for soil and water conservation. The improvement of this grass through the conventional breeding is very limited due to low rate of seed germination and male sterility. Protoplast fusion technology is a useful technique that can solve this limitation in vetiver improvement. Therefore, this study aimed to optimize the conditions of protoplast isolation and fusion between two vetiver grass, including Kamphaeng Phet 2 (V. zizanioides) and Prachuap Khiri Khan (V. nemoralis), then study on the suitable media for protoplast culture. The results showed that in Kamphaeng Phet 2, protoplast was isolated from leaves using the combination of 0.5% cellulase onozuka R-10 and 0.5% macerozyme R-10 for 24 h of incubation time which produced highest number of protoplasts yield (6.12x105 protoplasts/ml) and the high viability of protoplasts (98.16 %). While protoplast of Prachuap Khiri Khan was isolated from leaves using 1.0% cellulase onozuka R-10 and 0.4% macerozyme R-10 in combination for 24 h which gave the highest number of protoplasts yield (6.80x105 protoplasts/ml) and the high viability of protoplasts (96.56%). Then, protoplasts fusion of vetiver between Kamphaeng Phet 2 and Prachuap Khiri Khan was perform using polyethylene glycol (PEG). The results showed that the highest percentage of binary fusion (43.45%) and the viability of protoplasts (89.63%) were obtained from 10% PEG-MW6000 with 30 min incubation period. Protoplasts of Kamphaeng Phet 2, Prachuap Khiri Khan and binary fusion were cultured using hanging drop method on liquid KM8P medium and modified KM8P media. KM8P-4, containing KM8P medium supplemented with 0.2 mg/l 2,4-D, 2 mg/l NAA and 1.5 mg/l BA was the most suitable medium for increasing the capability of the cell wall formation in protoplast culture of Kamphaeng Phet 2, Prachuap Khiri Khan and binary fusion which were obtained the highest percentage of cell wall formation (9.76, 9.58 and 9.87%, respectively) after 24 h of culture. Then, these protoplasts which had cell wall were cultured on MS medium (Murashige and Skoog’s) for plant regeneration. However, the protoplast had no cell division, microcolony formation, callus and plant regeneration.

แฝก (Vetiveria spp.) เป็นพืชตระกูลหญ้าที่ถูกนำมาใช้ในการอนุรักษ์ดินและน้ำ การปรับปรุงพันธุ์แฝกด้วยวิธีปกติยังมีข้อจำกัด เนื่องจากเมล็ดมีอัตราการงอกต่ำ และดอกของแฝกมักมีลักษณะเป็นหมัน ซึ่งการนำเทคโนโลยีการรวมโพรโทพลาสต์มาช่วยในการปรับปรุงพันธุ์แฝกจะช่วยลดข้อจำกัดดังกล่าวได้ ดังนั้นงานวิจัยนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาสภาวะที่เหมาะสมต่อการแยกและการรวมโพรพลาสต์แฝกกำแพงเพชร 2 และประจวบคีรีขันธ์ และศึกษาอาหารที่เหมาะสมในการเพาะเลี้ยงโพรโทพลาสต์แฝก จากการทดลองพบว่า การแยก โพรโทพลาสต์จากใบแฝกกำแพงเพชร 2 ด้วยเอนไซม์ cellulase onozuka R-10 ความเข้มข้น 0.5 เปอร์เซ็นต์ ร่วมกับ macerozyme R-10 ความเข้มข้น 0.5 เปอร์เซ็นต์ และการแยกจากใบแฝกประจวบคีรีขันธ์ ด้วยเอนไซม์ cellulase onozuka R-10 ความเข้มข้น 1 เปอร์เซ็นต์ ร่วมกับ macerozyme R-10 ความเข้มข้น 0.4 เปอร์เซ็นต์ บ่มเป็นระยะเวลา 24 ชั่วโมง ให้จำนวนโพรโทพลาสต์สูงสุด เท่ากับ 6.12x105 และ 6.80x105 โพรโทพลาสต์ต่อมิลลิลิตร ตามลำดับ และให้ความมีชีวิตของโพรโทพลาสต์ที่สูง เท่ากับ 98.16 และ 96.56 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ จากนั้นชักนำให้เกิดการรวมระหว่างโพรโทพลาสต์แฝกกำแพงเพชร 2 และประจวบคีรีขันธ์ ด้วยสารละลาย PEG-MW6000 ความเข้มข้น 10 เปอร์เซ็นต์ เป็นระยะเวลา 30 นาที ให้เปอร์เซ็นต์การรวมโพรโทพลาสต์แฝกแบบ binary fusion และเปอร์เซ็นต์ความมีชีวิตหลังการรวมโพรโทพลาสต์สูงสุด เท่ากับ 43.45 และ 89.63 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ จากนั้นนำโพรโทพลาสต์แฝกกำแพงเพชร 2 ประจวบคีรีขันธ์ และโพรโทพลาสต์แฝกลูกผสมแบบ binary fusion มาเพาะเลี้ยงด้วยวิธี hanging drop ในอาหารเหลวสูตร KM8P-4 ที่ประกอบด้วยอาหาร KM8P ที่เติม 2,4-D ความเข้มข้น 0.2 มิลลิกรัมต่อลิตร ร่วมกับ NAA ความเข้มข้น 2 มิลลิกรัมต่อลิตร และ BA ความเข้มข้น 1.5 มิลลิกรัมต่อลิตร สามารถเพิ่มประสิทธิภาพในการสร้างผนังเซลล์ขึ้นมาใหม่ของโพรโทพลาสต์แฝกกำแพงเพชร 2 ประจวบคีรีขันธ์ และโพรโทพลาสต์แฝกลูกผสมแบบ binary fusion ได้ดีที่สุด พบเปอร์เซ็นต์การสร้างผนังเซลล์ เท่ากับ 9.76, 9.58 และ 9.87 ตามลำดับ หลังการเพาะเลี้ยงที่ 24 ชั่วโมง อย่างไรก็ตามโพรโทพลาสต์ที่มีการสร้างผนังเซลล์แล้วไม่สามารถแบ่งเซลล์ และพัฒนาไปเป็นไมโครโคโลนี แคลลัส และต้นที่สมบูรณ์ได้ เมื่อย้ายไปเพาะเลี้ยงในอาหารสูตร MS