Improvement of Bacillus subtilis using cold plasma for fermented feed production from agriculture wastes

Abstract

Bacteria play a crucial role in the degradation of agricultural waste by secreting several enzymes during fermentation. Xylanase is one of the key enzymes involved in this process. Therefore, this research aimed to enhance the xylanase enzyme activity of a mutant Bacillus subtilis (MT3.4) which is used to produce fermented animal feed from agricultural waste. This was accomplished through a second mutation induction using cold plasma technology, employing argon and helium gases to produce the plasma and administering exposure lengths of 1-5 minutes. After plasma treatment, 581 bacterial isolates were found to grow on Luria-Bertani (LB) agar. Among these, isolate MT2-428 demonstrated a 3.5-fold enhancement in xylanase enzyme activity relative to the B. subtilis MT3.4. The genetic changes in the MT2-428 mutant strain were examined using the High Annealing Temperature-Random Amplified Polymorphic DNA (HAT-RAPD) technique with five random primers. The results revealed a distinct DNA fingerprint in MT2-428 compared to B. subtilis MT3.4. The optimal conditions for xylanase enzyme activity from the MT2-428 mutant strain were determined to be pH 6 and a temperature of 60 degrees Celsius. Subsequently, the MT2-428 mutant strain was then subjected to a 7-day degradation assay using three types of agricultural waste materials, including durian peel, sugarcane bagasse, and corn husk, in comparison with a control group, the wild type (B. subtilis), and the first mutant bacterial strain (B. subtilis MT3.4). The experimental results revealed that the MT2-428 mutant strain exhibited superior degradation capability compared to other fermentation conditions, yielding the highest reducing sugar release values. Thus, the MT2-428 mutant strain is suitable for application in the production of fermented animal feed from agricultural waste materials.

แบคทีเรียมีบทบาทสำคัญในการกำจัดวัสดุเหลือใช้ทางการเกษตร โดยการปลดปล่อยเอนไซม์หลายชนิดในขณะการหมัก ซึ่งเอนไซม์ไซลาเนสเป็นหนึ่งในเอนไซม์ที่มีบทบาทสำคัญในกระบวนการย่อย งานวิจัยนี้จึงมีวัตถุประสงค์เพิ่มประสิทธิภาพกิจกรรมของเอนไซม์ไซลาเนสจากแบคทีเรีย Bacillus subtilis พันธุ์กลาย (MT3.4) ที่ใช้ในการผลิตอาหารสัตว์หมักจากเศษวัสดุเหลือใช้ทางการเกษตร โดยการชักนำให้เกิดการกลายพันธุ์ครั้งที่ 2 ด้วยเทคโนโลยีพลาสมาเย็น โดยใช้ก๊าซอาร์กอนและฮีเลียมในการกำเนิดพลาสมา และระยะเวลาในการอาบพลาสมา 1-5 นาที พบแบคทีเรียจำนวน 581 ไอโซเลทเจริญบนอาหารแข็ง Luria-Bertani (LB) ภายหลังจากการอาบพลาสมา และพบว่าไอโซเลท MT2-428 มีค่ากิจกรรมเอนไซม์ไซลาเนสสูงขึ้น 3.5 เท่าเมื่อเทียบกับ B. subtilis MT3.4 เมื่อนำแบคทีเรียพันธุ์กลาย MT2-428 มาตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงในระดับดีเอ็นเอด้วยเทคนิค High Annealing Temperature-Random Amplified Polymorphic DNA (HAT-RAPD) โดยใช้ไพร์เมอร์แบบสุ่มจำนวน 5 ไพร์เมอร์ พบว่าแบคทีเรียพันธุ์กลาย MT2-428 มีลายพิมพ์ดีเอ็นเอที่แตกต่างจาก B. subtilis MT3.4 และจากการศึกษาสภาวะที่เหมาะสมต่อกิจกรรมของเอนไซม์ไซลาเนสจากแบคทีเรียพันธุ์กลาย MT2-428 พบว่าสภาวะที่เหมาะสมต่อกิจกรรมของเอนไซม์ไซลาเนส คือ ค่าความเป็นกรด-ด่าง เท่ากับ 6 และอุณหภูมิ 60 องศาเซลเซียส จากนั้นนำแบคทีเรีย MT2-428 มาทดสอบการย่อยวัตถุดิบ 3 ชนิด ได้แก่ เปลือกทุเรียน, ชานอ้อย และเปลือกข้าวโพด เป็นเวลา 7 วันเปรียบเทียบกับชุดควบคุม, แบคทีเรียพันธุ์ดั้งเดิม และแบคทีเรียพันธุ์กลายครั้งที่ 1 B. subtilis MT3.4 ผลการทดสอบพบวาแบคทีเรียพันธุ์กลาย MT2-428 มีความสามารถในการย่อยวัตถุดิบได้ดีกว่าการหมักเงื่อนไขอื่น ๆ โดยให้ค่าการปลดปล่อยน้ำตาลรีดิวซ์สูงที่สุด ดังนั้นแบคทีเรียพันธุ์กลาย MT2-428 เหมาะสมสำหรับการประยุกต์ใช้ผลิตอาหารสัตว์หมักจากเศษวัสดุเหลือใช้ทางการเกษตร