Bacterial Mutation by Low-Energy Plasma for Dairy Cattle Feed

Abstract

The aim of this work was to induce three bacterial species, including Bacillus amyloliquefaciens (cellulase-producing bacteria), Bacillus subtilis (xylanase-producing bacteria) and Enterococcus faecium (lactic acid bacteria), by using a low-energy plasma technique. The mutant bacteria were screened by hydrolysis capacity (H.C.) on carboxymethyl cellulose substrate. Then, the investigation of molecular changes, enzyme mechanisms, and fermentation processing from agricultural wastes, such as durian peel, corn cob, pineapple peel, and pineapple cork, was observed. The results showed that lactic acid bacteria, E. faecium, showed a mutant with higher lactic acid activity than control, approximately 12% under argon plasma treatment at 1.5/1.5 min on MRS broth. B. amyloliquefaciens, a cellulase-producing bacteria, was treated by low-energy plasma immersion ion implantation (PIII) to enhance their cellulase activity. According to a protein modeling analysis, replacing K370 with glutamic acid was proposed to form a hydrogen bond to Y436 a shorter distance (2.6 Å) than the control (5.4 Å), which may allow the structure to be more compact and stable, contributing to higher catalytic efficiency. Moreover, xylanase-producing bacteria, B. subtilis, were bombarded by an atmospheric pressure plasma jet (APPJ) and higher catalytic activity was screened. Sequence analysis revealed only a single amino acid substitution from threonine to serine at position 162 (T162S) to be in the glycosyl hydrolase family (GH11). To reduce feed costs, agricultural wastes were an optional choice as raw material to feed under fermentation processing, which required bacteria. The quality of fermented feed after fermented by mutant bacteria showed that the mutant bacteria produced protein at a higher level than the control, increasing 20–30%. The pH was decreased by 10–20%, indicating the quality of fermentation associated with lactic acid content increased by 10–20%. After that, the dairy cattle were fed for a month. The amount of milk and milk composition (fat, protein, lactose, and ash) were not different from the control, although the feed cost was decreased by 40%.

ในงานวิจัยนี้ ได้ทำการปรับปรุงพันธุ์แบคทีเรีย 3 ชนิด ได้แก่ Bacillus amyloliquefaciens (แบคทีเรียที่ผลิตเซลลูเลส), Bacillus subtilis (แบคทีเรียที่ผลิตไซลาเนส) และ Enterococcus faecium (แบคทีเรียกรดแลคติก) ด้วยเทคนิคพลาสมาพลังงานต่ำ แบคทีเรียกลายพันธุ์ถูกคัดเลือกด้วยค่า H.C. (Hydrolysis capacity) จากนั้นจึงศึกษาการเปลี่ยนแปลงของโมเลกุล กลไกของเอนไซม์ และทดลองหมักในเศษวัสดุเหลือใช้ทางการเกษตร เช่น เปลือกทุเรียน ซังข้าวโพด เปลือกสับปะรด และจุกสับปะรด จากผลการศึกษาพบว่า Enterococcus faecium ชุดกลายพันธุ์ให้ค่ากรดแลคติกสูงกว่าชุดควบคุมถึง 12% ภายใต้เงื่อนไขการระดมยิงด้วยก๊าซอาร์กอนพลาสมา ที่ 1.5/1.5 นาที B. amyloliquefaciens แบคทีเรียที่ผลิตเอนไซม์เซลลูเลสถูกระดมยิงด้วยพลาสมาความดันสูญญากาศ (P-III) เพื่อเพิ่มกิจกรรมของเอนไซม์เซลลูเลส จากการวิเคราะห์แบบจำลองโปรตีน โครงสร้างแสดงให้เห็นการแทนที่ K370 ด้วยกรดกลูตามิก ซึ่งคาดว่าพันธะไฮโดรเจนกับ Y436 มีระยะห่างสั้นกว่า (2.6 อังสตรอม) เทียบกับชุดควบคุมมีระยะห่าง (5.4 อังสตรอม) ช่วยให้โครงสร้างแน่นมากขึ้น ส่งผลให้กิจกรรมของเอนไซม์สูงขึ้นนอกจากนี้ Bacillus subtilis ถูกระดมยิงด้วยพลาสมาความดันบรรยากาศ และคัดเลือกแบคทีเรียที่ให้ค่ากิจกรรมสูง จากการวิเคราะห์ลำดับกรดอะมิโนแสดงให้เห็นว่า การแทนที่กรดอะมิโนเพียงตัวเดียวจากThreonine ไปเป็น Serine ที่ตำแหน่ง 162 (T162S) อยู่ใน glycosyl hydrolase family(GH11) ส่งผลต่อกิจกรรมของเอนไซม์ไซลาเนส เศษวัสดุเหลือใข้ทางการเกษตรจึงเป็นอีกทางเลือกที่ใช้เป็นวัตถุดิบเพื่อลดต้นทุนค่าอาหาร เมื่อศึกษาคุณภาพของอาหารหมัก พบว่า แบคทีเรียนพันธุ์กลายให้ปริมาณโปรตีนเพิ่มสูงขึ้นกว่าชุดควบคุม 20-30% และค่า pH ลดลง 10-20% สัมพันธ์กับปริมาณกรดแลคติกที่เพิ่มสูงขึ้น หลังจากนั้น ทดสอบการเลี้ยงในโคนมโดยใช้ระยะเวลาเป็นหนึ่งเดือน พบว่า ปริมาณนมและองค์ประกอบของน้ำนม(ไขมัน โปรตีน แลคโตส และเถ้า) ไม่แตกต่างจากกลุ่มควบคุม แต่ราคาต้นทุนค่าอาหารลดลงไป 40%