EVALUATION OF THE EFFICACY OF BACILLUS SUBTILIS AS14 AND AS80 IN CONTROLLING AVOCADO FRUIT ROT DISEASE.

Abstract

One major issue in the cultivation of avocados is avocado fruit rot. Chemical control has detrimental effects on both the environment and human health, despite being a quick and easy solution. The purpose of this study was to assess the effectiveness of antagonistic Bacillus subtilis strains AS14 and AS80, which were isolated from the soil of the avocado rhizosphere, as well as their mutant strains that were created using a cold plasma approach, in controlling the disease known as avocado fruit rot. The B. subtilis strains AS14 and AS80 were treated with argon and helium plasma at a plasma-generating potential of 85 volts and a gas flow rate of 2 liters per minute for 1, 2, 3, and 5 minutes. A total of 581 surviving bacterial isolates were obtained on Luria Bertani (LB) agar. The efficacy of these isolates in inhibiting the mycelial growth of Fusarium spp. was evaluated using the dual culture method on Potato Dextrose Agar (PDA). Four mutant isolates of B. subtilis strain AS80 namely 80MT15, 80MT144, 80MT163, and 80MT165 showed significantly higher inhibitory effects compared to the wild type strain (B. subtilis AS80). The average percentage of mycelial growth inhibition was 83.4%, 86.3%, 85.2%, and 82.8%, respectively, while the wild type strain showed a 76.4% inhibition after 14 days of incubation. Moreover, there was no inhibition observed in isolate 80MT123. Microscopic examination of the fungal hyphae adjacent to the bacterial colonies revealed morphological changes such as coiling, swelling, and shortened septal compartments, which were absent in the control hyphae (not in contact with bacteria). Furthermore, the ability of the five selected isolates and the wild type strain to control fruit rot disease was tested on avocado fruit. Bacterial isolate, 80MT165, exhibited the highest average inhibition of disease development (77.59%), followed by 80MT163 (75.71%), 80MT144 (74.12%), and 80MT15 (71.15%) while 80MT123 showed no inhibitory effect. Analysis of specific enzymatic activities (cellulase, amylase, protease, and chitinase) revealed that chitinase and cellulase enzymes were primarily responsible for the inhibition of mycelial growth in B. subtilis strain AS80 and the four effective mutant isolates. Therefore, these four mutant isolates are suitable for development as biological agent for the effective and environmentally friendly control of avocado fruit rot disease.

โรคผลเน่าเป็นปัญหาที่สำคัญในกระบวนการผลิตอะโวคาโด การจัดการโรคด้วยสารเคมีเป็นวิธีการที่สะดวกและรวดเร็ว แต่ส่งผลกระทบทางลบด้านสุขภาพและสิ่งแวดล้อมตามมา งานวิจัยนี้จึงมีวัตถุประสงค์เพื่อประเมินประสิทธิภาพการควบคุมโรคผลเน่าของอะโวคาโดด้วยแบคทีเรียปฏิปักษ์ Bacillus subtilis สายพันธุ์ AS14 และAS80 ที่คัดแยกได้จากดินบริเวณรากต้นอะโวคาโด และแบคทีเรียพันธุ์กลายของทั้งสองสายพันธุ์ที่ได้จากการชักนำด้วยเทคนิคพลาสมาเย็น จากการนำ B. subtilis สายพันธุ์ AS14 และAS80 มาอาบด้วยพลาสมาอาร์กอนและฮีเลียม ความต่างศักย์ในการกำเนิดพลาสมา 85 โวลต์ อัตราการไหลของแก๊ส 2 ลิตรต่อนาที เป็นเวลาออก 1, 2, 3 และ 5 นาที พบว่าแบคทีเรียที่รอดชีวิตบนอาหารแข็ง Luria Bertani (LB) จำนวน 581 ไอโซเลท และจากการประเมินประสิทธิภาพการยับยั้งการเจริญของเส้นใยเชื้อรา Fusarium spp. ด้วยวิธี Dual culture บนอาหารแข็ง Potato dextrose agar (PDA) พบแบคทีเรียพันธุ์กลายของ B. subtilis สายพันธุ์ AS80 จำนวน 4 ไอโซเลท ได้แก่ 80MT15, 80MT144, 80MT163 และ 80MT165 มีความสามารถในการยับยั้งการเจริญของเส้นใยเชื้อราอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับ B. subtilis สายพันธุ์ AS80 โดยมีค่าเฉลี่ยร้อยละการยับยั้งการเจริญเติบโตของเส้นใยของเชื้อราเท่ากับ ร้อยละ 83.4, 86.3, 85.2 และ 82.8% ตามลำดับ ในขณะที่สายพันธุ์ดั้งเดิมมีค่าการยับยั้งร้อยละ 76.4 หลังจากบ่มเป็นเวลา 14 วัน และไม่พบความสามารถในการยับยั้งการเจริญของเส้นใยเชื้อราของแบคทีเรียพันธุ์กลาย 80MT123 และเมื่อนำเส้นใยของเชื้อราด้านที่ติดกับโคโลนีของแบคทีเรียมาตรวจสอบภาตใต้กล้องจุลทรรศน์ใช้แสงแบบเลนส์ประกอบ พบลักษณะหงิกงอ บวม และข้อปล้องสั้น แตกต่างกับบริเวณเส้นใยของเชื้อราด้านควบคุม (ไม่ติดกับแบคทีเรีย) จะมีเส้นใยตรง เรียบ และข้อปล้องยาว จากนั้นทดสอบความสามารถในการยับยั้งการเกิดโรคผลเน่าบนผลอะโวคาโดด้วยแบคทีเรียสายพันธุ์ดั้งเดิม (B. subtilis สายพันธุ์ AS80) และสายพันธุ์กลายทั้ง 5 ไอโซเลท พบว่า แบคทีเรียไอโซเลท 80MT165 มีค่าเฉลี่ยการยับยั้งการเกิดโรคสูงที่สุด (ร้อยละ 77.59) รองลงมาคือ 80MT163, 80MT144 และ 80MT15 ซึ่งมีค่าเฉลี่ยการยับยั้งการเกิดโรคเท่ากับร้อยละ75.71, 74.12 และ 71.15 ตามลำดับ และ 80MT123 ไม่มีความสามารถในการยับยั้งการเกิดโรค และจากการตรวจสอบกิจกรรมจำเพาะของเอนไซม์เซลลูเลส อะไมเลส โปรติเอส และไคติเนส พบว่าเอนไซม์ที่สำคัญในการยับยั้งการเจริญเส้นใยของ B. subtilis สายพันธุ์ AS80 และแบคทีเรียพันธุ์กลายทั้ง 4 ไอโซเลท คือ เอนไซม์ไคติเนสและ เซลลูเลส ดังนั้น แบคทีเรียพันธุ์กลายทั้ง 4 ไอโซเลทจึงเหมาะสมที่จะนำไปใช้ในการพัฒนาเป็นสารชีวภัณฑ์ในการควบคุมโรคผลเน่าของอะโวคาโดได้อย่างมีประสิทธิภาพและเป็นมิตรต่อมนุษย์และสิ่งแวดล้อม